Что означает выражение «активность фермента»? Среды для определения сахаролитических свойств. Структура: цепь из тысяч аминокислот

Рассмотрим кратко факторы, определяющие скорость реакций, катализируемых ферментами, и вопросы об активировании и ингибировании ферментов.

Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со временем, однако кривая зависимости скорости ферментативных реакций от времени (см.

рис. 4.17) не имеет обычно той общей формы, которая характерна для гомогенных химических реакций. Уменьшение скорости ферментативных реакций во времени может быть обусловлено угнетающим действием продуктов реакции, уменьшением степени насыщения фермента субстратом (поскольку по мере протекания реакции концентрация субстрата снижается), частичной инактивацией фермента при заданных температуре и рН среды. Следует учитывать, кроме того, влияние скорости обратной реакции, которая может оказаться существенной по мере увеличения концентрации продуктов ферментативной реакции. Учитывая эти обстоятельства, при исследовании скорости ферментативных реакций в тканях и биологических жидкостях обычно определяют начальную скорость реакции в условиях, когда скорость ферментативной реакции приближается к линейной (в том числе при достаточно высокой для насыщения фермента концентрации субстрата).

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Из приведенного выше материала вытекает важное заключение, что одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата. При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис. 4.12 и 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически уже не ока­зывает влияния на скорость реакции; в этих случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента.

Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентра­ции фермента. На рис. 4.18 представлена зависимость между скоростью реакции и повышающимися количествами фермента в присутствии насыщающих концентра­ций субстрата. Существующая линейная зависимость между этими величинами показывает, что скорость реакции пропорциональна количеству присутствующего фермента.

УАктивирование и ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции, т. е. активность фермента, определяется так­же присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые увеличивают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов, встречаются разнооб-

Таблица 4.4. Ферменты, активируемые металлами

разные вещества. Так, соляная кислота активирует действие пепсина, желчные кис­лоты - панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа папаин и другие в значительной сте­пени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Полу­чены доказательства, что около одной четверти всех известных ферментов для про­явления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Мно­гие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена ферментативной активности; более того, для действия этого фермента цинк не может быть заменен никаким другим метал­лом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в част­ности енолаза активируется Mg 2 + , Mn 2 + , К + . В табл. 4.4 приведены примеры участия металлов в действии некоторых ферментов ".

Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в ряде случаев ионы металлов (Со 2 + , Mg 2 + , Zn 2 + , Fe 2+) выполняют функции простетических групп ферментов или служат акцеп­торами и донорами электронов или выступают в качестве электрофилов или нуклео-филов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+ через отрицательно заряжен­ную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органи­ческих веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соеди­нений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфос-фокиназу благодаря образованию истинного субстрата - магниевой соли АТФ. На­конец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (напри­мер, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отме­тить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов, см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы при физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказы­вают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пеп-

син, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Недавно открыты анти­ферменты (антиэнзимы), представляющие собой белки (или полипептиды), дей­ствующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина соевых бобов и сывороточный антитрипсин. Они образуют труднодиссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами. Иногда инги­битор может входить в состав сложных ферментов, например протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфорилирования - дефосфорилиро-вания в живых организмах. Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в част­ности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе про­теинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактива­ции фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или группу родственных ферментов. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из сферы химической реакции. Так, йодацетат 1СН 2 -СООН, его амид и этиловый эфир, парахлормеркурибензоат ClHg-CgH 4 -СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существен­ное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R- S H+ICH 2 -COOH-«-HI+R- S -CH2-COOH

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре. Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при иссле­довании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической подвижности, сколько по различию чувстви­тельности к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность хими­ческих реакций и природа участвующих ферментов. Таким образом, при применении йодацетата, фторида и других ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мы­шечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежу­точных метаболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромокси-дазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэсте-разы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Рациональная химиотерапия - направленное применение лекарственных препара­тов в медицине - должна основываться на точном знании механизма действия этих препаратов на биосинтез ферментов, сами ферменты или их регуляцию в организме. Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательные ингибиторы. Так, ингибитор трипсина, химотрипсина и калликреина - трасилол - широко приме­няется для лечения острого панкреатита. Избирательное ингибиторное действие не­которых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты служит основой для разработки эффективных методов синтеза химио-терапевтических препаратов. Этот путь открывает широкие возможности для регу­ляции синтеза ферментов и интенсивности метаболизма.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональ­ных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количесгвен-ному изучению на основе уравнения Михаэлиса - Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, име­ющими структуру, похожую на субстрат, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа ингибирования явля­ется торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фу-маровую:

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сход­ства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом переноса водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат)

все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром,! и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната: и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования" иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.19). В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от фермент-субстратного комплекса (ES) не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса, или ингибиторную констан­ту (ATj), можно, следуя теории Михаэлиса - Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации Е1-комплекса.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболева­ний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являю­щейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В 6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипири-доксин и аминоптерин (см. главу 5), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохимические процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющи­ми структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами необратимого ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-п-нитрофенилфосфата и синильной кис­лоты, заключающееся в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэли-са - Ментен, Лайнуивера - Бэрка или другими, например уравнением Эди - Хофсти:

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.

На рис. 4.20 видно, что при конкурентном типе ингибирования ингибитор уве­личивает значение К т (на величину, равную разнице в длине отрезков, отсекаемых на оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молеку­лами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.21) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина К т не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирова­ния (иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение F max сочетается с одновременным увеличением К т. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталити­ческому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата; для этого типа тормо­жения был предложен довольно неточный термин бесконкурентное ингиби-рование. Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соеди­нения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса ESI.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая возможный механизм ферментатив­ного катализа.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная сбалан­сированность катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. При этом в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, рас­пада и взаимопревращения сотен и тысяч разнообразных веществ, которые регули­руются множеством регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство внутрен­ней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рас­смотрены ниже.

_£Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой хими­ческой реакции, например: А + В <=* С + D концентрация компонентов реакции и со­ответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминиро-вания, катализируемой ферментом аланинаминотрансферазой:

Алании + а-Кетоглутарат +± Пируват + Глутамат

Этот тин регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в ре­альных условиях реакция обычно протекает в одном направлении, так как образо­вавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

^Изменение количества фермента. На бактериях хорошо изучен феномен индуци­рованного синтеза ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, например глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или адаптивному (после небольшого периода лагфазы) синтезу фермента галактозидазы (программи­рованному лактозным геном, см. главу 13), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм, индуцирующий синтез, изучен только для неболь­шого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серии- и треониндегидратазы, трипто-фанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцеро­генных веществ, алкалоидов, инсектицидов наблюдается резкое увеличение через несколько дней активности (соответственно количества) ферментов - гидроксилаз эндоплазматической сети клеток печени, окисляющих чужеродные вещества в неток­сичные для организма продукты. С другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

"-■ Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и под­желудочной железы синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к правращению проферментов в ак­тивные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в актив­ный трипсин в кишечнике в результате аутокатализа или под действием других про-теиназ (см. главу 11). Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присут­ствии соляной кислоты и также связано с отщеплением от профермента специфи­ческого ингибитора полипептидной природы. Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образу­ются проферменты.

Химическая модификация фермента. Некоторые белки при формировании третич­ной структуры подвергаются постсинтетической модификации (см. главу 1). Оказалось,

что ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтаза и др. - также контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфата-зой, уровень активности которых в свою очередь регулируется гормонами. Уровень активности ключевых ферментов обмена углеводов и соответственно интенсивность и направленность самих процессов обмена определяются соотношением фосфорили-рованных и дефосфорилированных форм этих ферментов. Химическая постсинтети­ческая модификация ферментов включает, кроме того, процессы ограниченного про-теолиза, метилирования, гликозилирования и другие, обеспечивая тем самым микро­скопический тип регуляции активности ферментов и соответственно физиологическую скорость процессов обмена веществ.

Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализи­рующего первую стадию.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E t .

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и ЦТФ. Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом, избирательно подав­ляет активность треониндегидратазы, катализирующей первое звено процесса превра­щения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций. Ана­логично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает ингибирую-щий эффект на первый фермент (аспартаткарбамоилтрансферазу), регулируя тем самым свой собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболизма в целом".

С другой стороны, в амфиболических процессах, выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2 , доказано существование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэргическими соединениями - индика­торами энергетического состояния клетки. Для амфиболических процессов уникаль­ным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того, актива­ция предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирую­щее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фер­мент гликогенсинтазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) ферментам, когда эффектор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно удаленном от активного центра. Взаимопревра­щения активного и неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 4.22. Присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации актив­ного центра молекулы фермента, в результате чего фермент теряет сродство к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в част­ности в S-образности этих кривых (отклонение от гиперболической кривой Михаэли-са - Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы в активном центре, способствуя тем самым увеличению скорости реакции. Кроме того, для аллостерических регуляторных фер­ментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации фер­мента.

Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механиз­мов, контролирующих скорость метаболических процессов и активность внутри­клеточных ферментов. Абсолютное количество присутствующего в клетке фермента регулируется скоростью его синтеза и распада. К регуляторным механизмам могут быть отнесены также конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение актив­ности одного из изоферментов (у множественных форм ферментов), влияние кон­центраций кофакторов и явление компартментализации. Механизм ком-партментализации играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространствен­но разъединяя с помощью биомембран ферменты со своими субстратами (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидро­литические ферменты, с цитоплазматическими веществами, на которые они действуют). Кроме того, этот механизм позволяет разделить несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласован­ных условиях измерения. Лри оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна

концентрации фермента. О ско­рости ферментативной -реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости об­разования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности Комиссия по ферментам Международного биохимического союза реко­мендовала стандартную между­народную единицу (Е или U): ! за единицу активности любого фермента принима­ется то количество его, которое в оптимальных условиях ката­лизирует превращение 1 микро­моля субстрата в минуту (мкмоль/мин). В связи с введе­нием Международной системы единиц (СИ) предложено новое определение ферментной едини­цы катал (кат, kat); 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реак­цию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). От­ношение международной еди­ницы (Е) к каталу можно вы­разить следующим образом: 1 кат=1 моль -с" " = 60 моль х х мин " = 60 10 6 мкмоль х х мин" 1 = 6 10 7 Е; или 1 Е = = 1 мкмоль мин ~" =

= (1/60) мкмоль с " = = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Та­ким образом, 1 Е фермента соответствует 16,67 нкат._23

Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25 °С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субртрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользу­ются производными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в се­кунду, принято называть числом оборотов, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44 000 мо­лекул перекиси водорода 1 .

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, лизосомы и др.) является чрезвычайно важным, особенно в препара­тивной энзимологии, когда перед исследователем поставлена задача изолировать и выделить фермент в чистом виде. Сравнительно легко обнаружить локализацию фермента методами цито- и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкуби­руют с соответствующими субстратами, и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением подходящих реактивов по развитию специфической окраски.

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей. Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре 0 - 4 °С. Примерная схема дифференциального центрифугирования гомо­генатов в высокоскоростных центрифугах представлена на рис. 4.23 ". Обычно распре­деление ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изоли­рованных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фрак­ции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее уда­ется изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которых занимает про­межуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку она происходит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования в центрифугах было показано, что ядер­ная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основным местом синтеза белка, как теперь установлено, является фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в растворимой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование и распад жирных кислот. Фермен­ты, катализирующие биосинтез жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы.

Для изолирования и выделения ферментов из биологических объектов в чистом (гомогенном) состоянии используется весь арсенал методов выделения белков в ин­дивидуальном виде, который был подробно рассмотрен выше (см. главу 1).

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современная классификация и номенклатура ферментов была разработана Ко­миссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждена на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве 2 .

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стреми­тельным ростом числа вновь открываемых с каждым годом ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, для одного и того же фермента подчас употребляли два или несколько названий, что вносилу путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не от­ражали тип катализируемой реакции.

До 1961 г. не было единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различ­ные принципы. Комиссией были рассмотрены три принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип - хими­ческая природа фермента, т. е. принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфат-протеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип - химическая природа субстрата, на который действу­ет фермент; по этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классификации положен тре­тий принцип - тип катализируемой реакции, который является специфич­ным для действия любого фермента; этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с назва­нием субстрата (субстратов) и служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно этой классификации ферменты делят на шесть главных клас­сов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисле­ния. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидо-редуктаза», например лактат: НАД" 1 " оксидоредуктаза для ЛДГ.

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кисло­род, анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на про­межуточный субстрат, но не на кислород, цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относятся также гемсодержащие ферменты ка-талаза и пероксидаза, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наиме­нование их составляется по форме: «донор: транспортируемая группа - трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азо­тистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метил- и фор-милтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.

Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молеку­лы воды. Наименование их составляется по форме: «субстрат - гидролаза». К ним относятся: эстеразы - ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза слож­ных эфиров гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей, фосфатазы и пеп-тидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей амидазы, ускоряющие разрыв кислотно-ангидридных связей, отличных от пептид­ных, и др.

Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв С-О, С-С, С-N и других связей, а также обратимые реакции отщепления различных групп

от субстратов не гидролитическим путем; эти реакции сопровождаются образование»!

двойной связи или присоединением групп к месту двойной связи. Ферменты обозна*!

чаются термином: «субстрат -лиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематичен

ское название: L-малат-гидролиаза) катализирует обратимое отщепление молекулй;

воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу"

входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.

Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие различные

типы реакций изомеризации. Систематическое название их составляется с учетом

типа реакции: «субстрат - цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутри­молекулярный перенос группы, фермент получает название мутазы.

К классу изомераз относят рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные, внутримолекулярные оксидоредуктазы, ка­тализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз, внутримолекулярные трансфера-зы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т. д.

Лш азы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляют по форме: «X: Y лигаза», где через X и Y обозначаются исходные вещества. В ка­честве примера можно назвать L-глутамат: аммиак лигазу (глутаминсинтетазу), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ синтези­руется глутамин.

СПИСОК ФЕРМЕНТОВ

На основании разработанной системы, которая служит основой как для класси­фикации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В списке фермен­тов (см. Номенклатуру ферментов, 1979) насчитывалось уже 2142 индивидуальных фермента; к настоящему времени их идентифицировано еще больше. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся систематическое (рациональ­ное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую ката-, лизирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Присвое­ние номера для каждого фермента рекомендуется проводить по четырехзначному шифру.

Таким образом, шифр каждого фермента содержит четыре цифры, раз­деленные точками, и составляется по следующему принципу. Первая цифра указы­вает номер одного из шести главных классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на при­роду той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз - на тип гидролизуемой связи и т. д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (обозначаемые подподклассами), отличающиеся химической природой соединений (доноров или акцепторов), участвующих в данной подгруппе реакций. Номер, точнее цифра, подподкласса ставится на третьем месте в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз - тип отщепляемой группы и т. д. Первые три цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставится на четвертом месте в шифре.

Таким образом, каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью четырех цифр, имеет соответствующий шифр, под которым он внесен в список фер­ментов. В качестве примера в табл. 4.5 приводятся два фермента из списка.

Следует особо отметить, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соот­ветствует общепринятой в органической химии классификации химических реакций, несмотря на то, что ферменты катализируют по существу те же реакции.

Понятие активности фермента

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность - более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

• масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата;
• время, потраченное на реакцию;
• количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие - это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей - бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества - моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени - минута, час, секунда,
• единицы массы или объема - грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные - катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т. д.

Например, известно,

2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях - оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

Активность ферментов. Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (МЕ) и катал (кат). За международную единицу активности фермента принято такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моля субстрата за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МЕ). При бимолекулярной реакции A + В = С + D за единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля А или В, или 2 мкмолей А (если В = А), за 1 мин.

Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность – это число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка.

Молекулярная активность (число оборотов фермента) – число молекул субстрата, подвергающееся превращению одной молекулой фермента за 1 мин при полном насыщении фермента субстратом. Она равна числу единиц активности фермента, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Понятие молекулярной активности применимо только для чистых ферментов.

Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активности каталитического центра . Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин в расчете на один активный центр.

Активность ферментов сильно зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0−50°С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования фермент-субстратного комплекса и всех последующих событий катализа. При повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоффа). Однако дальнейшее возрастание температуры (>50°С) сопровождается повышением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом – значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность.

Зависимость активности ферментов от значения рН среды имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды , при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого значения в ту или другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа). При работе с ферментами необходимо поддерживать рН с помощью соответствующего буферного раствора.

Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (веществ, частично или полностью снижающих активность) и активаторов (веществ, увеличивающих активность). Их роль выполняют катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др.

Принципы ферментативной кинетики. Суть кинетических исследований состоит в определении максимальной скорости ферментативной реакции (V max) и константы Михаэлиса К М. Ферментативная кинетика изучает скорости количественных превращений одних веществ в другие под действием ферментов. Скорость ферментативной реакции измеряют по убыли субстрата или приросту образующегося продукта за единицу времени, либо по изменению концентрации одной из смежных форм кофермента.

Влияние концентрации фермента на скорость реакции выражается в следующем: если концентрация субстрата постоянна (при условии избытка субстрата), то скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. Для кинетических исследований используют концентрацию фермента 10  8 М активных центров. Оптимальное значение концентрации фермента определяют из графика зависимости активности фермента от его концентрации. Оптимальным считается значение, лежащее на плато полученного графика в области значений активности фермента, мало зависящих от его концентрации (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Зависимость скорости ферментативной реакции

от концентрации фермента

Для изучения влияния концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции сначала строят кинетическую кривую, отражающую изменение концентрации субстрата (S 1) или продукта (Р 1) во времени (рис. 4.4) и измеряют начальную скорость (V 1) реакции как тангенс угла наклона касательной к кривой в нулевой точке.

Рис. 4.4. Кинетические кривые ферментативной реакции

Построив кинетические кривые для других значений концентрации данного субстрата (S 2 , S 3 , S 4 и т. д.) или продукта (Р 2 , Р 3 , Р 4 и т. д.) и определив начальные скорости (V 2, V 3 , V 4 и т. д.) реакции, строят график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (при постоянной концентрации фермента), который имеет вид гиперболы (рис. 4.5).

Рис. 4.5. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции

от концентрации субстрата

Кинетика многих ферментативных реакций описывается уравнением Михаэлиса  Ментен. При постоянной концентрации фермента и малых значениях концентрации субстрата [S] начальная скорость реакции прямо пропорциональна [S] (рис. 4.5). В этом случае говорят о полунасыщении фермента субстратом, когда половина молекул фермента находится в форме фермент-субстратного комплекса и скорость реакции V = 1/2V max . В отношении субстрата реакция имеет 1-й порядок (скорость реакции прямо пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества) или 2-й порядок (скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ).

При высоких значениях концентрации субстрата [S] скорость реакции почти не зависит от [S]: при дальнейшем увеличении [S] скорость реакции растет все медленнее и в итоге становится постоянной (максимальной) (рис. 4.5). При этом достигается полное насыщение фермента субстратом, когда все молекулы фермента находятся в форме фермент-субстратного комплекса и V = V max . В отношении субстрата реакция имеет 0-й порядок (скорость реакции не зависит от концентрации реагирующих веществ).

В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Согласно этой модели, образование специфического фермент-субстратного комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа.

k 1 k 3

Е + S ⇄ ЕS → Е + Р

Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ЕS-комплекс. Константа скорости этого процесса k 1 . Судьба ЕS-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на фермент Е и субстрат S с константой скорости k 2 , либо подвергнуться дальнейшему превращению, образуя продукт Р и свободный фермент Е, с константой скорости k 3 . При этом постулируется, что продукт реакции не превращается в исходный субстрат. Это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта невелика.

Скорость катализа определяют в стационарных условиях , когда концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрация исходных веществ и конечных продуктов изменяется. Это имеет место в том случае, когда скорость образования ЕS-комплекса равна скорости его распада.

Можно ввести новую константу К М – константу Михаэлиса (моль/л), которая равна

Уравнение Михаэлиса – Ментен , выражающее количественное соотношение между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата, имеет вид

(4.2)

Это уравнение соответствует графику зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата , когда [S] намного ниже К М, V = V max [S] / К М, т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата , когда [S] намного выше К М, V = V max , т. е. скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.

Если [S] = К М, то V = V max /2.

Таким образом, К М равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной .

Константа Михаэлиса (К М) и максимальная скорость реакции (V max) – важные характеристики скорости при разных концентрациях субстрата. V max – величина постоянная для каждого фермента позволяет оценить эффективность его действия.

Константа Михаэлиса показывает сродство субстрата к ферменту (в случае, когда k 2 >> k 3): чем меньше К М, тем больше сродство и выше скорость реакции, и наоборот. Каждый субстрат характеризуется своей величиной К М для данного фермента и по их значениям можно судить о субстратной специфичности фермента. Константа Михаэлиса зависит от природы субстрата, температуры, рН, ионной силы раствора и наличия ингибиторов.

В связи с тем, что определение V max и К М непосредственно из графической зависимости Михаэлиса – Ментен (рис.4.5) является неоднозначным, прибегают к линеаризации данного уравнения. Для этого его преобразуют в такую форму, чтобы графически оно выражалось прямой. Существует несколько методов линеаризации, среди которых наиболее часто применяют методы Лайнуивера – Бэрка и Эди – Хофсти.

Преобразование Лайнуивера – Бэрка имеет вид

(4.3)

Строят график зависимости 1/V = f (1/[S]) и получают прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величину 1/V max ; отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс дает величину −1/К М, а тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс равен К М /V max (рис. 4.6). Этот график позволяет более точно определять V max. Как мы увидим ниже, из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования активности фермента.

Рис. 4.6. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Лайнуиверу – Бэрку)

Метод Эди – Хофсти основан на преобразовании уравнения Михаэлиса – Ментен путем умножения обеих его частей наV max:

(4.4)

График в координатах V иV /[S] представляет собой прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величинуV max, а отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс, – величинуV max /К М (рис. 4.7). Он позволяет очень просто определять К М иV max , а также выявлять возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на предыдущем графике.

Рис. 4.7. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Эди – Хофсти)

Ингибирование активности ферментов. Действие ферментов можно полностью или частично подавить определенными химическими веществами – ингибиторами . По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность связывания ингибитора с ферментом.

Обратимые ингибиторы – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и при их удалении активность фермента восстанавливается. Обратимое ингибирование может быть конкурентным, неконкурентным и бесконкурентным.

Примером конкурентного ингибирования является действие структурных аналогов субстрата, которые могут связываться с активным центром фермента похожим способом, как и субстрат, не превращаясь однако в продукт и препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом, т. е. имеет место конкуренция между субстратом и ингбитором за связывание с активным центром фермента. В результате образования комплексов фермент-ингибитор (EI) концентрация ES-комплексов уменьшается и, как следствие, падает скорость реакции. Иными словами, конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат.

Измерение скоростей реакций при разных концентрациях субстрата позволяет отличать конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике зависимости 1/V =f (1/[S]) прямые пересекают ось ординат в одной точке 1/V max независимо от присутствия ингибитора, но в присутствии ингибитора увеличивается тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, т. е.V max не изменяется, а К М увеличивается, что свидетельствует об уменьшении сродства субстрата к ферменту в присутствии ингибитора (рис. 4.8). Следовательно, при достаточно высокой концентрации субстрата в условиях конкуренции за активный центр фермента, когда субстрат вытесняет ингибитор из активного центра, ингибирование может быть устранено, и скорость катализируемой реакции восстанавливается. При этом уравнение Михаэлиса − Ментен имеет вид

(4.5)

где [I] – концентрация ингибитора; K i – константа ингибирования.

Константа ингибирования характеризует сродство фермента к ингибитору и представляет собой константу диссоциации ЕI-комплекса:

(4.6)

В присутствии конкурентного ингибитора тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс увеличивается на величину (1 + [I]/K i ).

Рис. 4.8. Конкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу − Бэрку

При неконкурентном ингибировании ингибитор отличается по структуре от субстрата и связывается не с активным, а с аллостерическим центром фермента. Это ведет к изменению конформации активного центра фермента, что сопровождается снижением каталитической активности фермента. Причем ингибитор может связываться не только со свободным ферментом (Е + I → EI), но и с фермент-субстратным комплексом (ES + I → ESI). Обе формы EI и ESI не активны. Субстрат и ингибитор могут быть одновременно связаны молекулой фермента, но участки их связывания не перекрываются. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Ингибитор не препятствует образованию ES-комплексов, но тормозит превращение субстрата в продукт. Вследствие этого V max уменьшается, т. е. в присутствии ингибитора пересечение прямой с осью ординат произойдет в более высокой точке (рис. 4.9). В той же мере возрастает и тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, равный К М /V max I . К М в отличие от V max не изменяется, поэтому неконкурентное ингибирование не может быть устранено увеличением концентрации субстрата.

Рис. 4.9. Неконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Максимальная скорость реакции V max I в присутствии неконкурентного ингибитора описывается уравнением

(4.7)

В частном случае бесконкурентного ингибирования , когда ингибитор связывается только с ES-комплексом и не связывается со свободным ферментом, на графике зависимости 1/V = f (1/[S]) прямые параллельны друг другу и пересекают оси ординат и абсцисс в разных точках (рис. 4.10).

Рис. 4.10. Бесконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Необратимые ингибиторы – это высокореакционноспособные соединения различной химической природы, которые могут взаимодействовать с функционально важными группами активного центра, образуя прочные ковалентные связи. Это приводит к безвозвратной потере активности фермента. В связи с этим теория Михаэлиса – Ментен, основанная на предположении, что присоединение ингибитора к ферменту носит обратимый характер, в данном случае неприменима.

Примером необратимого ингибирования служит взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам цистеиновных остатков фермента и образуют при этом меркаптиды – практически недиссоциирующие соединения, либо ковалентная модификация фермента под действием алкилирующих агентов.

Во многих случаях истинное молярное количество фермента неизвестно. Поэтому принято о количестве фермента судить по скорости реакции, которую он катализирует в определенных условиях измерения. Определение активности фермента - это косвенное определение его количества, так как скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации действующего фермента.

По решению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза (1961) за международную единицу активности фермента принимается такое его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в одну минуту при 30°С (мкмоль/мин). Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка или на 1 мг препарата.

Согласно международной системе мер (1972) рекомендована новая международная единица активности фермента - катал. Катал соответствует количеству фермента, способному вызвать превращение 1 моль субстрата в продукт в одну секунду (моль/с).

Отношение прежней единицы активности фермента к ка- талу составляет мкмоль/мин - 60 мкмоль/с - 16,67 нмоль/с. Следовательно, единица активности фермента соответствует 16,67 нкат.

Нормальное функционирование органов и тканей организма является отражением координированного функционирования всех регуляторных систем, включая ферментные. Можно полагать, что изменение активности одного фермента или его отсутствие приводит к нарушению постоянства метаболизма. При любой этиологии болезни, инфекционной или инвазионной, возникают изменения активности ферментных систем, и в этом смысле все болезни рассматриваются как метаболические.

По причине нарушений определенных ферментных систем в организме выявлены многие болезни животных и человека. Так, известны анемии, вызываемые недостатком в эритроцитах пируваткиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, метге- моглобинредуктазы. Часто патогенез патологического процесса нелегко определить. Чтобы выяснить, какая ферментная система нарушена, следует изучить многие факторы; необходима тканевая биопсия, выбор соответствующих диагностических реакций, активаторов или ингибиторов фермента.

Необходимость определения активности сывороточных ферментов основана на предположении, что изменения их активности отражают изменения, происходящие в определенном органе. Можно выявить в сыворотке ферменты двух типов: один является специфическим для сыворотки, выполняя конкретную роль, тогда как другой тип фермента обычно присутствует в сыворотке в очень низкой концентрации и не несет определенной функции.

При ряде патологий (инсульт) возможны изменения клеточной проницаемости и увеличение числа разрушенных клеток, что приводит к выходу внутриклеточных ферментов в плазму. В этих случаях первыми в плазме обнаруживаются ферменты низкой молекулярной массы.

В диагностике патологии отдельного органа было бы идеально определить активность фермента, характерного для данного органа. Однако это невозможно осуществить, поскольку метаболизм в разных органах протекает одинаково. И все же можно установить тканевые или органоспецифические ферменты, активность которых отражает функцию определенных тканей или органов. Например, повышение активности кислой фосфатазы в крови характеризует наличие опухоли простаты; повышение активности лактатдегидрогеназы и креатинфосфо- киназы в сыворотке крови является весьма информативным диагностическим тестом, который отражает повреждение сердечной мышцы. Увеличение активности изоферментов ЛДГ^ и ЛДГ 2 в сыворотке крови указывает на инфаркт миокарда, повышение активности ЛДГ и аспартатаминотрансферазы свидетельствует о распаде клеточных элементов в костном мозге. Связь между активностью ферментов и патологическим процессом не всегда объяснима, но эти данные, несомненно, имеют большой клинический интерес.

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.