Стационарная фаза роста в жидкой питательной среде. Рост бактерий в культуре

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :

1. лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста;

3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4. фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

Общие положения

Определение 1

Размножение – процесс воспроизведения себе подобных организмов, ведущий к увеличению бактериальных клеток в популяции.

Для бактерий характерны следующие виды размножения:

• бинарное деление на две части - деление происходит симметрично относительно поперечной и продольной оси, образуются одинаковые дочерние клетки
• почкование - вариант бинарного деления, образующаяся на одном из полюсов почка растет до размеров материнской клетки и отделяется; симметрия присутствует только относительно продольной оси
• множественное деление - клетка претерпевает ряд последовательных быстрых бинарных делений внутри фибриллярного слоя материнской клетки, что приводит к образованию баеоцитов – мелких клеток, количество которых колеблется от 4 до 1000, в результате разрыва клеточной стенки материнского организма баеоциты выходят наружу;
• размножение спорами ;
• путем фрагментации клеток , имеющих нитевидную форму;
• конъюгация (половой процесс, обмен клетками генетическим материалом);
• трансформация (перенос «голой» ДНК);
• трансдукция (перенос генетической информации при помощи бактериофагов).

Репликация бактериальной хромосомной ДНК

Репликация хромосомы в бактериальной клетке происходит по полуконсервативному типу, что приводит к удвоению ДНК нуклеоида – бактериального ядра. При этом типе репликации двухспиральная молекула ДНК раскрывается, а каждая отдельная нить ДНК достраивается комплементарной нитью.

Процесс репликации ДНК происходит от начальной точки ori и катализируется ДНК-полимеразами. В области ori хромосома клетки бактерии связана с цитоплазматической мембраной. В первую очередь происходит деспирализация (раскручивание) двойной цепи ДНК. Образуется репликативная вилка, представленная двумя разветвленными цепями. Одна цепь, достраиваясь связывает нуклеотиды от 5 - к 3 -концу, а у второй достраивание происходит посегментно.

Репликация ДНК включает следующие этапы:

• инициация;
• элонгация (рост цепи);
• терминация.

В результате репликации образуются две хромосомы, которые прикрепляются к цитоплазматической мембране или ее производным, и удаляются друг от друга мере увеличения клетки. После образования перегородки ил перетяжки деления происходит окончательное разъединение хромосом. Перегородки деления разрушают аутолитические ферменты.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде

Замечание 1

Если бактерии засеяны в определенный объем питательной среды, то размножаясь и потребляя питательные вещества, они ведут к истощению этой среды, что, в свою очередь, приводит к прекращению роста микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов в такой системе является периодическим культивированием, а культуру бактерий называют непрерывной культурой.

Рост культуры на жидкой питательной среде может быть:

• придонным:
• диффузным;
• поверхностным.

Рост периодической культуры можно разделить на несколько фаз. Эти фазы можно показать в виде отрезков кривой размножения микроорганизмов (рисунок 1).

• Лаг-фаза. Период между посевом бактерий и началом процесса размножения. Длится $4-5$часов.Микроорганизмы увеличиваются в объеме и готовятся к делению. Увеличивается количество белка, нуклеиновых кислот и других соединений.
• Фаза логарифмического роста . Период интенсивного деления клеток. Продолжительность $5-6$ часов. Клетки бактерий наиболее чувствительны.
• Фаза стационарного роста (максимальной концентрации бактерий). Количество жизнеспособный клеток постоянно, наблюдается М-концентрация (максимальная концентрация). Продолжительность фазы зависит от вида и особенностей бактерий, культивирования.
• Фаза гибели бактерий . В условиях истощения питательной среды, а также накопления продуктов метаболизма происходит отмирание бактерий.

Продолжительность от $10$ часов до нескольких недель.

Размножение бактерий на плотной питательной среде

При росте на плотных питательных средах бактерии формируют изолированные колонии с ровными или неровными краями округлой формы, разного цвета и консистенции. Цвет питательной среды зависит от пигмента бактерии. Среди микроорганизмов наиболее распространенными пигментами являются каротины, меланины, ксантофиллы. Многие пигменты обладают антибиотикоподобным, антимикробным действием.

Замечание 2

Форма, цвет, вид колоний на плотных питательных средах учитываются при идентификации микроорганизмов, отборе колоний для создания чистых культур.

Рост бактерий – это увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Рост клетки не беспределен. После достижения критических размеров клетка подвергается делению.

Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения.

Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние. У большинства грамположительных бактерий деление происходит путем синтеза поперечной перегородки, идущей от периферии к центру. Клетки большинства грамотрицательных бактерий делятся путем перетяжки.

Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. Репликация начинается в одной избранной области, называемой origin (начало), имеющей определенную последовательность нуклеотидов. Здесь может возникать одна или две репликативные вилки. В процессе репликации участвуют более 20 ферментов. Так как бактериальная ДНК двуспиральная, перед репликацией она должна быть разделена. В этом процессе участвуют ферменты хеликаза, которая расплетает двойную спираль и топоизомераза, которая предотвращает образование вторичных завитков. SSB-белок связывается с одноцепочечной ДНК, предотвращая повторное скручивание в двойную спираль. В результате образуется репликативная вилка. Синтез новых цепей ДНК осуществляется ферментом ДНК-полимиразой. Для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепи, полимеразе требуется затравка – праймер. Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку РНК, комплементарную матричной цепи, со свободным 3 / - концом. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравка удаляется. Так как цепи ДНК в дуплексе антипарралельны, то направление расплетания двойной цепи совпадает лишь с направлением синтеза ДНК на одной матрице, которая называется ведущей. На комплементарной цепи ДНК синтезируется короткими фрагментами, которые впоследствии сшиваются в одну цепь ДНК-лигазами. Процесс репликации ДНК бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК.

При внесении бактерий в питательную они растут и размножаются до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост и размножение прекращаются. Если не прибавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получаем статистическую бактериальную культуру.

Фазы размножения бактерий:

1. Начальная (лаг-фаза) охватывает промежуток времени от момента посева бактерий до начала их роста. Ее продолжительность составляет в среднем 2-5 часов и зависит от состава питательной среды.

2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза. Характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и питательной среды. Время удвоения клеток называется временем генерации. Это время варьирует от нескольких минут до нескольких часов.

3. Стационарная фаза наступает когда число клеток перестает увеличиваться. При уменьшении в питательной среде концентрации питательных веществ, снижении парциального давления кислорода, накоплении токсических продуктов обмена, уменьшается скорость роста бактерий. Продолжительность стационарной фазы составляет несколько часов и зависит от вида бактерий.

4. Фаза отмирания наступает вследствие накопления кислых продуктов обмена или в результате автолиза под влиянием собственных ферментов. Продолжительность этой фазы колеблется от десятка часов до нескольких недель.

Собственно под ростом бактерий обычно подразумевают координированную репликацию всех компонентов бактерий. Поскольку деление бактериальной клетки приводит к образованию двух особей, то их число растет в геометрической прогрессии: 2 0 -2 1 -2 2 -2 3 -..2 n . Регуляторное действие на рост бактерий оказывают качество питательной среды и условия выращивания.

Рост популяции клеток в ограниченном жизненном пространстве (периодическая культура) может быть разделён по меньшей мере на четыре фазы (рис. 4-12).

После внесения в среду бактерии адаптируются к её условиям и размножаются сравнительно медленно (лаг-фаза ). Затем наступает фаза экспоненциального роста (экспоненциальная фаза ). Далее среда истощается, в ней аккумулируются токсические продукты метаболизма, что проявляется снижением темпов размножения и прекращением увеличения числа клеток (стационарная фаза ).

Таким образом, рост в периодической культуре подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. В последующем бактериальная культура может погибнуть либо значительно сократиться (фаза отмирания). Спорообразующие виды переходят в стадию споруляции, у споронеобразующих видов возможно образование анабиотических форм (см. ниже). В некоторых случаях дополнительно выделяют фазу ускорения роста (начало экспоненциальной фазы) и фазу замедления роста (переход к стационарной фазе).

Лаг-фаза роста бактерий соответствует периоду физиологического приспособления, включающего индукцию ферментов, синтез и сборку рибосом. Продолжительность фазы зависит главным образом от возраста посевного материала (инокулята) бактерий и предшествовавших условий культивирования Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то бактериям необходимо время для адаптации к новым условиям. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от имевшихся в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может потребовать синтеза новых ферментов, в которых ранее не было необходимости.

Экспоненциальная фаза роста бактерий (логарифмическая ) характеризуется максимальной скоростью клеточного деления. Для конкретного вида бактерий в конкретных условиях роста время генерации (то есть время, необходимое для удвоения количества бактерий) постоянно в течение всей логарифмической фазы, но вариабельно у различных видов и штаммов, а также зависит oт состава среды и условий культивирования. Время генерации на оптимальной среде может был коротким (у кишечной палочки 20 мин), либо продолжительным (у Mycobacterium tuberculosais 6 ч). В этой фазе в среде происходит максимальное накопление метаболитов бактерий (например, токсинов, бактериоцинов).

Стационарная фаза роста бактерий . В течение этого периода доступность важнейших питательных веществ становится лимитирующим фактором. Устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и процессом отмирания клеток. Спорообразующие бактерии (например родов Bacillus и Clostridium) способны переходить в фазу споруляции, активирующуюся при нахождении бактерий в условия ограниченного питания. В определённый момент соотношение отмирающих, вновь образующихся и покоящихся клеток становится стабильным; подобное состояние известно как максимальная стационарная фаза. Биомасса бактерий в стационарной фазе обозначают как «урожай», или «выход биомассы» (разница между максимальной и исходной биомассой); или «экономический коэффициент», если прирост биомассы отнесён к единице лимитирующего рост субстрата.

Фаза отмирания (спада , лизиса ) включает период логарифмической гибели, переходящий в период уменьшения скорости отмирания бактерий. Причины гибели бактерий в нормальных питательных средах до конца не ясны. Понятны случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Иногда бактерии разрушаются под действием собственных ферментов (аутолиз). Скорость отмирания широко варьирует в зависимости от условий обитания и особенностей микроорганизма (например, энтеробактерии отмирают медленно, а бациллы - быстро).

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :

1. лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста;

3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4. фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.